Começava então uma segunda fase do conflito, com a transferência da iniciativa -- do Exército paraguaio para o aliado. Fortalecidos, com um efetivo de cinqüenta mil homens, os aliados lançaram-se à ofensiva. Sob o comando do general Manuel Luís Osório, e com o auxílio da esquadra imperial, transpuseram o rio Paraná, em 16 de abril de 1866, e conquistaram posição em território inimigo, em Passo da Pátria, uma semana depois. Estabeleceram-se em 20 de maio, em Tuiuti, onde sofreram um ataque paraguaio quatro dias depois. A batalha de Tuiuti, considerada a mais renhida e sangrenta de todas as que se realizaram na América do Sul, trouxe expressiva vitória às forças aliadas.

O caminho para Humaitá, entretanto, não fora desimpedido. O comandante Mitre aproveitou as reservas de dez mil homens trazidos pelo barão de Porto Alegre e decidiu atacar as baterias de Curuzu e Curupaiti, que guarneciam a direita da posição de Humaitá, às margens do rio Paraguai. Atacada de surpresa, a bateria de Curuzu foi conquistada em 3 de setembro. Não se obteve, porém, o mesmo êxito em Curupaiti, onde em 22 de setembro os aliados foram dizimados pelo inimigo: cinco mil homens morreram.